EXTRACCIÓN:

La extracción es uno de los pasos más importantes en la purificación, identificación y obtención de compuestos fenólicos. 

Diagrama representativo de las etapas más comunes en la determinación analítica de analitos en muestras.

MUESTRAS SÓLIDAS

Dentro de todos los métodos de extracción de muestras sólidas encontramos:

ABTS

Se basa en la capacidad para atrapar radicales presentes en el medio. El radical catiónico de color verde azulado ABTS•+ se genera por la interacción del ABTS con persulfato de potasio. El radical ABTS•+ es un compuesto estable y soluble en metanol. Por lo tanto, se evalúa la capacidad antioxidante de la muestra en función de la habilidad para disminuir la concentración del radical. 

DPPH

Se basa en la habilidad para atrapar radicales presentes en el medio. La molécula de DPPH• se caracteriza por ser un radical libre estable, que en disolución metanólica presenta un color violeta intenso. Cuando la solución de DPPH• se mezcla con una sustancia que puede donar un átomo de hidrógeno (antioxidante), reduce al radical DPPH• con la pérdida del color violeta, el cual es estequiométrico con respecto al número de electrones que capture, tornándose de violeta a un amarillo pálido. 

FRAP

Un volumen de 10 µL de las muestras, se mezcla con 90 µL de agua destilada y 900 µL del reactivo FRAP (2,5 mL de la solución 2,4,6- tripiridil-s-triazina a una concentración de 10 µM en HCl 40 mM; 2,5 mL de FeCl3 20 µM y 25 mL de buffer acetato 0,3 µM a un pH de 3.6). La absorbancia se lee a 593 nm después de 7 minutos.

MUESTRAS LÍQUIDAS

En el caso de muestras líquidas es posible proceder directamente a su análisis, realizando la dilución adecuada en otro disolvente en el que sean solubles; también se pueden liofilizar y tratarlas como muestras sólidas. Aquellas muestras líquidas alcohólicas se suelen tratar en un evaporador rotatorio para la eliminación del alcohol y el residuo sólido se redisuelve en un disolvente adecuado, como es el caso de los vinos y ciertas bebidas alcohólicas.

1. El método más común es la extracción con un disolvente orgánico o mezclas acuosas de disolventes alcohólicos, que se basa en la transferencia de masa desde la muestra al disolvente de extracción según la solubilidad del analito en dicho disolvente. Los disolventes más utilizados son los disolventes alcohólicos puros o mezclas acuosas de los mismos.

2. También se encuentra la extracción asistida por ultrasonidos, (UAE - Ultrasound Assisted Extraction), donde se utiliza el disolvente sometido a ultrasonidos para la extracción de los compuestos de interés de las muestras. La eficacia de la extracción utilizando ultrasonidos se le atribuye al fenómeno de cavitación que ocurre en el disolvente al atravesarlo una onda ultrasónica. Durante la aplicación del ultrasonido se forman y se comprimen burbujas cavitatorias; debido al acúmulo de energía se produce un colapso de las burbujas que provoca la generación localizada de grandes cantidades de presión y temperatura y de una "onda de choque" que pasa a través del medio, que no es otro que la mezcla disolvente-muestra.

Dibujo 1:  Dibujo explicativo de la formación, compresión y colapso de las burbujas generadas en el disolvente de extracción debido a la cavitación.

3. Extracción asistida por microondas, MAE (Microwave Assisted Extraction). Las microondas son ondas electromagnéticas de frecuencias entre 300 MHz y 300 GHz. Las extracciones en las que se utilizan las microondas se basan en la absorción de la energía de las microondas por las moléculas de compuestos polares, ya que la energía es proporcional a la constante dieléctrica de la molécula, por lo que produce la rotación de los dipolos en el campo magnético lo que provoca la generación de calor. Por lo tanto estas extracciones utilizan el calor generado por el uso de las microondas.

4. Extracción con líquidos presurizados, PLE (Pressurized Liquid Extraction). En esta extracción se combinan altas temperaturas (50-200 ºC) y altas presiones (100-140 atm) con disolventes líquidos, sin alcanzar el punto crítico de los mismos, es decir, se trabaja por encima de la temperatura de ebullición del disolvente, pero éste se mantiene líquido por medio de las altas presiones (figura 14). De esta forma se consiguen extracciones más rápidas y eficaces de muestras sólidas y semisólidas. Cuando en esta técnica se utiliza agua como disolvente, se denomina extracción con agua subcrítica (SWE).

Dibujo 2Diagrama de fases esquemático para el disolvente de extracción en función de la presión y la temperatura.

Resumen de algunos métodos para las extracciones de compuestos fenólicos no convencionales

MUESTRAS BIOLÓGICAS

Para poder analizar los antioxidantes que hay en las muestras biológicas como puede ser la orina necesitamos el número de muestra de 10 personas.

Criterios de inclusión

UNA BUENA SALUD


        ACEPTEN Y FIRMEN EL CONSENTIMIENTO


Criterios de exclusión

TENER PROBLEMAS DE RESPIRACIÓN

INFLAMACIÓN EN LAS ENCÍAS

FUMAR

Existen numerosas técnicas pero la que nosotros utilizaremos en nuestro experimento es el ensayo de Folin-Ciocalteau que se basa en que los antioxidantes reaccionan con el reactivo y dan lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada espectrofotométricamente a 765 nm.


La oxidación de los polifenoles es
lo que causa que aparezca la coloración azulada. Se trata de un método sensible
y preciso, que presenta varias variaciones dependiendo de los volúmenes utilizados.



Para el procedimiento primero elegimos a los voluntarios para  realizar este experimento, y les pedimos a la mitad de ellos que tomarán algunos alimentos ricos en estos compuestos y a la otra mitad les pedimos que
intentarán evitar este tipo de alimentos, todo esto por un día, para que al día siguiente recogiésemos su orina por la mañana.

Una vez que teníamos su orina recogida, la congelamos.
Para el ensayo, en los tubos de reacción se colocaron 200 µL de cada muestra y se adicionaron 10 mL de solución diluida (1:10) de reactivo de Folin-Ciocalteu) más 1,8 mL de agua destilada. Se agitó y se dejó en reposo 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 8 mL de solución al 7,5% de Na2CO3 y se agitó
nuevamente. La curva de calibración se preparó empleando ácido gálico como
sustancia patrón con diluciones de concentraciones.


ANÁLISIS:

Las técnicas analíticas para la determinación de antioxidantes son el conjunto de métodos que nos permiten extraer compuestos antioxidantes de muestras líquidas, solidas o biológicas.

Algunos de lo métodos son:

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La cromatografía es un método de separación de sustancias en mezclas, utilizado para la determinación de antioxidantes en un cuerpo. La mezcla a resolver se introduce en un sistema formado por un fluido o fase móvil, que circula en contacto a la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla que poseen mayor afinidad por la fase estacionaria, disminuirán la velocidad de avance y se separarán de aquellos que tengo mayor afinidad por la fase móvil.


MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS

 Utiliza métodos matemáticos y estadísticos para proporcionar información química de un cuerpo. 


PARAFAC

Es un método de descomposición que se realiza en triadas o componentes trilineales  

Aunque el método más utilizado es:

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

La colorimetría es una técnica que tiene busca determinar la absorción de luz visible por una muestra, que puede ser una sustancia pura o bien una mezcla o disolución. Esta técnica nos da información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolución. 

El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela monocromática a través de una muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente.

La absorción de radiación por una muestra está regida por la ley de Lambert - Beer. Esta ley establece que la luz absorbida por una muestra es mayor cuanto más grande es el número de moléculas sobre las que incide la radiación. Es decir, la absorción de una solución es directamente proporcional a su concentración.  

Muchos compuestos tienen espectros característicos de absorción en la región visible y ultravioleta y esto hace posible la identificación de dichos materiales en una mezcla.

Para llevar a cabo las mediciones, necesitamos tomar como referencia la "curva espectral codificada" que asigna valores numéricos a la respuesta de los estímulos de los colores.


Figura 1: Flavonoides obtenidos de una naranja